Florey est né à Adélaïde, en Australie-Méridionale, fils d'un directeur d'école. Il a fréquenté le St Peter's College d'Adélaïde et l'Université d'Adélaïde, où il a obtenu un baccalauréat ès sciences en 1921 et un doctorat en médecine en 1924.
Après avoir obtenu son diplôme de médecine, Florey a travaillé au Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research à Melbourne, où il a rencontré Ernst Chain. En 1928, ils ont rejoint la Sir William Dunn School of Pathology de l'Université d'Oxford, où ils ont commencé à travailler sur le développement de la pénicilline.
La pénicilline avait été découverte en 1928 par Alexander Fleming, mais elle n’avait pas encore été transformée en médicament utilisable. Florey et Chain ont réussi à isoler le principe actif de la pénicilline et à le purifier afin de pouvoir l'injecter aux patients. Ils ont également développé des méthodes de production massive de pénicilline, ce qui a permis de l’utiliser largement pendant la Seconde Guerre mondiale.
Les travaux de Florey et Chain sur la pénicilline ont sauvé d'innombrables vies pendant la Seconde Guerre mondiale et révolutionné le traitement des maladies infectieuses. Florey a reçu le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1945 et a été fait chevalier en 1944.
Florey était également un administrateur et un éducateur distingué. Il a été vice-chancelier de l'Université d'Oxford de 1959 à 1962 et président de la Royal Society of London de 1960 à 1965. Il a également été membre de l'Académie australienne des sciences et de l'Académie américaine des arts et des sciences. , et l'Académie nationale des sciences.
Florey est décédé d'un accident vasculaire cérébral à Oxford en 1968. Il est considéré comme l'un des scientifiques australiens les plus importants du XXe siècle et ses travaux sur la pénicilline ont sauvé des millions de vies.